enFarma Vol. 26 No. 3

< Previous40 Vol. 26 • No. 3 Artículo Técnico Resumen L a implementación de métodos microbiológicos alter- nativos como la actividad del agua ha sido incentivada por la Farmacopea de los Estados Unidos y entidades reguladoras locales tales como el INVIMA (Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos), gracias a que la actividad del agua puede usarse como un indicador de la carga microbiológica y estabilidad organoléptica de produc- tos farmacéuticos sólidos no estériles tales como tabletas, cápsulas, pastillas y materias primas sólidas. Sin embargo, la implementación de la actividad de agua como un indicador microbiológico y organoléptico está completamente inex- plorada en productos derivados apícolas destinados para el uso de nuevas formulaciones con ﬁ nes terapéuticos y cos- méticos. El objetivo principal de este estudio es cuantiﬁ car la actividad de agua de biorreguladores apícolas tales como el propóleo, jalea real y polen, con el ﬁ n de determinar si la actividad de agua se puede utilizar como un indicador de calidad microbiológico en productos biológicos destinados a ser utilizados como principios activos de productos de cuidado personal, suplementos dietarios y farmacéuticos. Introducción Los derivados apícolas tales como el propóleo, polen y jalea real han emergido recientemente como biorreguladores Caracterización microbiológica y organoléptica de biorreguladores apícolas para uso terapéutico y cosmético, a través de métodos microbiológicos alternativos Por: Prada-Ramírez Harold Alexis1, Peña-Romero Romel1, Gonzalez-Alarcon Sandra Judith1, Bautista-León Inírida1, Montes-Tamara Juan Pablo1, David Díaz-Baez 2 y Gloria Inés Lafaurie2 biológicos eﬁ caces, que los conviertes en principios acti- vos esenciales para el desarrollo de nuevas formulaciones farmacéuticas dirigidas a tratamientos terapéuticos y cos- méticos. Gracias al amplio espectro de funciones biológicas descritas para cada uno de los derivados apícolas, la imple- mentación de estos productos como principios activos de productos cosméticos, suplementos dietarios y farmacéu- ticos, los posiciona como biorreguladores esenciales para mitigar enfermedades de alta incidencia global como los son el cáncer de mama, osteoporosis, diabetes, caries dental y obesidad, entre otros [1,2,3]. Por ejemplo, el propóleo ha emergido como un ingrediente valioso en pastas dentales y enjuagues bucales debido a sus propiedades antimicrobianas que ayudan a combatir las bacterias causantes de la placa, la gingivitis y el mal aliento, ofreciendo una alternativa natural a los compuestos químicos tradicionales [1,2,3]. A su vez, el polen de abeja se puede utilizar como ingrediente en productos de cuidado personal y/o incluso consumirse como suplemento nutricio- nal. Asimismo, la jalea real se ha empleado históricamente como potenciador de la salud en la medicina tradicional ya que, dentro de sus propiedades, se han informado ac- tividades antioxidantes, antiproliferativas, antimicrobianas, neuroprotectoras, antiinﬂ amatorias, inmunomoduladoras antienvejecimiento y estrogénicas [1,2,3]. 42 Vol. 26 • No. 3 Artículo Técnico Teniendo en cuenta el creciente consumo de productos apícolas en el mundo como consecuencia del aumento por la demanda de principios activos naturales para el desarrollo de ﬁ toterapéuticos, nutracéuticos, suplementos dietarios y productos de cuidado personal, la implementación de méto- dos microbiológicos alternativos es vitales para garantizar estándares de calidad altos que garanticen la calidad micro- biológica y estabilidad organoléptica de los biorreguladores apícolas [4,5,6,7,8,9]. La implementación de metodologías novedosas para evaluar la calidad microbiológica y or- ganoléptica de los biorreguladores es fundamental teniendo en cuenta que actualmente en Colombia no existe una normatividad o estándar que evalué la calidad del propóleos crudo o sus extractos, de hecho, el único producto que por ahora tiene legislación oﬁ cial para su control es la miel. Son pocas las pruebas estandarizadas que se encuentran disponibles para establecer la calidad biológica de los com- ponentes presentes en los extractos propóleos [10]. Aun con la gran demanda de productos producidos a partir de la jalea real, polen sólido y propóleo, en la actualidad, las sustancias como las ceras y las resinas que determinan la calidad de los propóleos, jalea real y polen sólido no se uniﬁ - can como norma, y cada país o productor tiene sus propios estándares de calidad. Sin embargo, los esfuerzos en investi- gación se encaminan hacia el proceso de la estandarización internacional de los propóleos, jalea real y polen sólido [11]. Tal y como se describe en los capítulos generales de la USP (922 y 1112), la actividad de agua (Aw) puede ser con- siderada como un indicador de la estabilidad microbiológica, ﬁ sicoquímica y organoléptica de productos farmacéuticos no estériles tales como tabletas, cápsulas, pastillas y ma- terias primas sólidas [4,5,12,13]. Asimismo, la actividad de agua se utiliza como una herramienta fundamental para el desarrollo de formulaciones. De este modo, actividades de agua muy por debajo de 0.75 no permiten el crecimiento de microorganismos y retardaran procesos químicos como la autohidrólisis. Actividades de agua inferiores a 0.75 son incapaces de promover el crecimiento microbiano, dado que ni los hongos más xerofílicos ni las levaduras más osmofílicas son capaces de crecer en productos con actividades de agua muy por debajo a 0.75. Adicional, las bacterias tanto gram- positivas como gramnegativas no toleran actividades de agua inferiores a 0.89 [4,5,12,13]. Sin embargo, estudios recientes llevados a cabo en laboratorios Coaspharma, pusieron de maniﬁ esto que el almacenamiento de las materias primas es de vital importancia para garantizar niveles estables de actividad de agua durante tiempos de cuarentena [5]. El objetivo principal de esta investigación es llevar a cabo una valoración microbiológica y organoléptica del propóleo, jalea y polen a través de la cuantiﬁ cación de la actividad de agua utilizando el método validado de punto de rocío espejo enfriado aprobado por el ente regulador colombia- no (INVIMA). De este modo, incluir dentro de los análisis rutinarios llevados a cabo en la industria farmacéuticas, la cuantiﬁ cación de la actividad de agua como una prueba microbiológica y organoléptica para valorar la calidad del propóleo, jalea y polen que se utilizará para el desarrollo de productos cosméticos, suplementos dietarios, homeopáticos, nutracéuticos y farmacéuticos. Materiales y Métodos (a) Reactivos Se utilizaron estándares de sales saturadas con actividades de agua conocidas para construir la curva de calibración y determinar el rango operativo y la linealidad del método de punto de rocío espejo enfriado. Se utilizaron cloruro de litio 13.41 mol/Kg +/- 0.5% aw = 0.25, cloruro de litio 8.57 mol/Kg +/- 0.5% aw = 0.50, cloruro de sodio 6.0 mol/Kg +/- 0.5% aw = 0.76, cloruro de sodio 2.33 mol/Kg +/- 0.5% aw = 0.92, y agua destilada aw = 1.00 +/- 0.003. Las siguientes materias primas apícolas propóleo, jalea real y polen, fueron suministrados por Vital Healthy Solution S.A.S. aliado de Laboratorios Coaspharma S.A.S, Bogotá, Colombia en la obtención de materias primas de grado cosmético y farmacéutico con trazabilidad desde su extracción siguiendo las Buenas Prácticas Apícolas (RESOLUCIÓN 8390 DE 2023). (b) Aqualab 4TE Aqualab 4 TE, instrumento utilizado para cuantificar la actividad de agua por el método de punto de rocío es- pejo enfriado. El sistema incluye instrumento de punto de rocío, con una cámara de medición de temperatura precisa, software Skala control para llevar cabo todas las funciones administrativas tales como la identificación de las muestras. El software Skala control almacena los datos primarios referente a las medidas de actividad del agua en el Amazon Web Site (AWS). El software Skala Control cumple con CFR 21 apartado 11, garantizando la integridad y conﬁ den- cialidad de los datos. El diseño caliﬁ cación (DQ), caliﬁ cación de instalación (IQ), caliﬁ cación operativa (OQ), validación de software (SV) y la caliﬁ cación de desempeño (PQ) del sistema fueron cumplidas satisfactoriamente, según linea- mientos de PDA. (c) Cuantiﬁ cación de la actividad de agua La cuantificación de la actividad de agua se llevó a cabo para el propóleo, jalea real y polen. El criterio de aceptabilidad para la actividad de agua que se usó fue aw ˂ 0.75. Para las mediciones de actividad de agua se dio uso del equipo AQUALAB 4TE WATER ACTIVITY METER. Para la medición rutinaria de actividad de agua se procedió a realizar veriﬁ caciones antes de su uso utilizando los es- tándares de 0.25 y 0.76. El equipo previamente fue calibrado utilizando los estándares de sales saturadas de 0.25, 0.50, 0.76, 0.92 y agua destilada, acorde con lo establecido en el capítulo 922 de la USP. 44 Vol. 26 • No. 3 Artículo Técnico (d) Pruebas microbiológicas y organolépticas A los biorreguladores apícolas analizados pólenes, jalea real y propóleo, se les realizaron pruebas microbiológicas y organolépticas “aspecto, color y olor”. Para los análisis microbiológicos se realizaron análisis de mesóﬁ los, hongos y levaduras, usando los métodos convencionales como la siembra directa en placas. Las pruebas microbiológicas y organolépticas se llevaron a cabo en paralelo y en simultáneo con la cuantiﬁ cación de la actividad de agua. Resultados y Discusión La actividad de agua ha sido ampliamente utilizada como un indicador de inocuidad microbiológica y de vida útil en la industria, debido a múltiples factores que se relacionan no sólo con los aspectos microbiológicos sino también con aspectos ﬁ sicoquímicos, organolépticos y estabilidad de formulaciones químicas [4,5]. Es tanto así, que existen estudios que determinan el rango de actividad de agua que se necesita para el crecimiento de microrganismo como Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Clostridium botulinum,Tipo A, Escherichia coli entre otros [13]. Donde podemos observar bacterias como Halobacterium halobium (bacteria halofílica) que posee la habilidad de sobrevivir en rango de 0.75 a 1 de Aw [13]. A su vez, se ha evidenciado que los hongos y las levaduras pueden soportar niveles aún más bajos de actividad de agua en comparación con las bacterias [13]. Existen estudios que relacionan la durabilidad de los pro- ductos con relación a la actividad de agua, en donde se tiene una relación inversamente proporcional entre durabilidad y actividad de agua (entre menos actividad de agua tiene un producto más tiempo se conserva) [4,5,12,13]. Por tanto, los estudios actuales hablan de la posibilidad de usar la actividad de agua como indicador de inocuidad microbiológica tal y como se describe en la USP capítulos 922 y 1112 [4,5,12,13]. Así, la inclusión de la actividad de agua como un indicador microbiológico y organoléptico se encuentra apoyado por la USP vigente. Sin embargo, la implementación de la actividad de agua como un indicador microbiológico y organoléptico en productos biológicos tales como la jalea real, propóleo y polen sólido, está completamente inexplorado. Actualmente, no existe literatura que muestre los niveles de actividad de agua en materias primas apícolas. Del mismo modo, no existe literaria que relacione los niveles de actividad de agua con características microbiológicas ni organolépticas. Por tanto, al cuantiﬁ car la actividad de agua de los biorreguladores apícolas: propóleo, jalea real y polen se facilita el acceso a la formulación y el desarrollo de pro- ductos cosméticos, farmacéuticos, suplementos dietarios y alimentos, utilizando este método como un indicador de calidad de los principios activos entregados por los provee- dores dedicados a las materias primas apícolas. La inocuidad microbiológica en derivados apícolas es un reto para las industrias de alimentos, cosméticos, suplementos dietarios y farmacéuticos teniendo en cuenta que a cifras de 2020 el inventario apícola colombiano se distribuye en aproximadamente 3,000 apicultores, ubicados en todo el país y una cantidad de 130 mil colmenas lo que daría un valor agregado a escala industrial. Este tipo de métodos promueve la certiﬁ cación de derivados apícolas de alta calidad para la transformación en productos farmacéuticos, nutricionales con efectos antimicrobianos, antinﬂ amatorios, hipoglucemiantes, anticáncer, así como productos de cuida- do personal y antienvejecimiento. En el presente estudio se cuantiﬁ co la actividad de agua de biorreguladores apícolas tales como la jalea real, propóleo y polen solido (Graﬁ ca 1). Graﬁ ca 1. Apariencia organoléptica de la jalea real, propóleo y polen sólido . Previo al uso de las materias primas apícolas analizadas, se garantizó un almacenamiento correcto con el propósito de garantizar estabilidad de sus características físicas y micro- biológicas originales. Las condiciones de almacenamiento para los biorreguladores apícolas se describen en la Tabla 1. Estudios recientes llevados a cabo en laboratorios Coas- pharma, pusieron de maniﬁ esto que las materias primas sólidas no son susceptibles a que sus atributos de calidad microbiológico, organolépticos y ﬁ sicoquímico se vean afectados, siempre que se garanticen condiciones idóneas de almacenamiento [5]. Tabla 1. Lista de biorreguladores analizados y condiciones de almacenamiento. Utilizando el método de punto de rocío espejo enfriado previamente validado y certiﬁ cado por el ente regulador INVIMA (Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos), se cuantiﬁ caron los niveles de actividad de agua del propóleo, jalea real y polen sólido (Tabla 2). De los tres biorreguladores apícolas analizados, la jalea real presentó niveles de actividad más altos (Aw=0.9680, n=6), lo cual lo convierte en un producto altamente susceptible a albergar el crecimiento de bacterias y hongos. Por tanto, siguiendo los lineamientos de la USP capítulo 1112, para llevar a cabo una valoración microbiológica a niveles de actividad de agua altos es mandatorio llevar a cabo recuentos microbiológicos por los métodos farmacopeicos de referencia. Sin embargo, la jalea real presentó recuentos microbiológicos dentro de especiﬁ caciones para uso cosmético (conteo de mesóﬁ los, 46 Vol. 26 • No. 3 Artículo Técnico hongos y levaduras < 150 ufc/mL, Tabla 3). La jalea real presentó ausencia de crecimiento de patógenos tales como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus (Tabla 3). A su vez, el polen sólido presentó niveles de actividad de agua bastante bajos (Aw=0.2749, Table 2). A estos niveles de actividad de agua ni los hongos más xerofíticos ni las levaduras más osmofílicas pueden crecer. En consonancia con niveles de actividad agua baja, el recuento de mesóﬁ los, hongos y levaduras presentó resultados dentro de especiﬁ - cación (< 150 ufc/g, Table 3). A su vez, el polen sólido pre- sentó ausencia de patógenos tales como E. coli, Paeruginosa y S. aureus (Tabla 3) Tabla 3. Recuento microbiológico y características organolépticas de los biorreguladores analizados. El propóleo presentó niveles bajos de actividad de agua (Aw=0.7791, Tabla 2). El conteo de mesóﬁ los, hongos y levaduras se encontró dentro de especificación micro- biológica (< 150 ufc/g, Table 3). Los derivados apícolas como la jalea real, propóleo y polen sólido han sido ampliamente reconocidos por tener una actividad antimicrobiana frente a un amplio espectro de bacterias, hongos y levaduras. Estos atributos biológicos inherentes a cada biorregulador apícola permiten un efecto de autopreservación evitando el daño de la materia prima a causa de crecimiento microbiano. Este efecto autopreservante facilita el uso de los derivados apícolas para hacer parte de nuevas formulaciones con ﬁ nes cosméticos. De hecho, su efecto preservante es tan impor- tante que se ha propuesto para remplazar preservantes como los parabenos [3,9]. La actividad de agua es reconocida como una medida de calidad de productos alimenticios y farmacéuticos. Sin em- bargo, su implementación como una herramienta predictiva de la carga microbiológica de productos farmacéuticos sóli- dos no estériles tiene que estar acompañada o respaldada por históricos microbiológicos de los últimos 20 lotes del producto terminado, materias primas y envase primario. A su vez, la regulación farmacéutica exige la validación de los procesos de manufactura y auditorías a proveedores para garantizar que todas estas aristas se encuentren alineadas con actividades de agua inferiores a 0.75. Por tanto, la cuantiﬁ cación de la actividad de agua como una herramienta predictiva de la carga microbiológica puede ser aplicable únicamente a aquellos biorreguladores apícolas que tengan actividades de agua iguales o inferiores a 0.75. Por tanto, la cuantiﬁ cación de la actividad de agua por el método farmacopeico validado de punto de rocío espejo enfriado puede ser aplicable para el polen sólido (Aw= 0.27) y el propóleo (Aw=0.77). Así, aunque el propóleo presenta niveles de actividad de agua ligeramente superiores a las descritas por la USP capítulo 1112 (Aw ≤ 0.75), sus propie- dades antibacterianas y antifúngicas has sido ampliamente descritas en la literatura cientíﬁ ca. En ese sentido, la Unidad de Investigación Básica Oral (UIBO) de la Universidad El Bosque ha puesto de maniﬁ esto que el propóleo puede ser utilizado como un ingrediente valioso en pastas dentales y enjuagues bucales debido a sus propiedades antimicrobianas, que ayudan a combatir las bacterias causantes de la placa, la gingivitis y el mal aliento, ofreciendo una al- ternativa natural a los compuestos químicos tradicionales [3]. De este modo, el presente estudio propone incluir la cuantificación de la actividad de agua como una herramienta para predecir la carga microbiológica del polen sólido y el propóleo. Sin embargo, tal y como lo deﬁ ne la USP en sus capítulos generales, es de vital importancia considerar otros ítems que en el caso de los biorreguladores biológicos de origen animal tienen que estar atados a sus propiedades auto preservantes e históricos microbiológicos. De los tres biorreguladores apícolas analizados, la jalea real parece ser la más suscepti- ble a contaminación microbiana (Aw= 0.96), por tanto, la implementación de la cuantiﬁ cación de la actividad de agua no tendría alcance para esta materia prima apícola. Conclusión En la actualidad en la industria alimenticia, cosmética y farmacéutica, la actividad de agua es considerada como un indicador de inocuidad microbiológica y de vida útil para múltiples productos. Sin embargo, la implementación como herramienta predictiva de la carga microbiológica de productos biológicos tales como el propóleo, jalea real y 47 Vol. 26 • No. 3 Artículo Técnico polen sólido, está completamente inexplorada. Así, la pre- sente investigación toma una especial relevancia cientíﬁ ca en donde se documenta la relación de la actividad de agua y la carga microbiológica (utilizando métodos farmacopeicos de referencia de conteo en placa) en productos derivados apícolas. Los resultados obtenidos para las materias primas propóleo, jalea real y polen sólido, indican que las condiciones actuales de almacenamiento son las adecuadas ya que las característi- cas organolépticas y microbiológicas no se vieron alteradas. Sin embargo, la implementación de la cuantiﬁ cación de la actividad de agua por el método de punto de rocío espejo Referencias: 1. Fuliang HU, Hepburn HR, Xuan H, Chen M, Daya S, Radloff SE. H. 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Bogotá Colombia. 2David Díaz-Baez y 2Gloria Inés Lafaurie pertenecen a la Unidad de Investigación Básica Oral—UIBO, Facultad de Odontología, Universidad El Bosque, Colombia. enfriado como herramienta para predecir la carga micro- biológica de productos apícolas sólo puede ser aplicable al polen sólido y propóleo, debido a que sus actividades de agua baja (Aw < 0.75) acompañado de sus propiedades antimicrobianas les permite auto preservarse. En soporte con esta idea, no se observaron recuentos microbiológi- cos fuera de especiﬁ cación microbiológica para estas dos materias primas. Sin embargo, la jalea real presentó niveles altos de actividad de agua, lo cual la vuelve altamente sus- ceptible a albergar el crecimiento de bacterias y hongos. Por tanto, para la valoración microbiológica de la jalea real se propone utilizar los métodos farmacopeicos de referencia de conteo en placa. Next >